無縫克隆是一種新型基因克隆技術(shù),，它可以同時將1到多個片段高效的插入到任何載體,。目前應(yīng)用較廣泛的無縫克隆方法是Gibson Assembly和In-Fusion Cloning,。這兩種方法的在原理上非常相似：都是通過外切酶產(chǎn)生黏性末端、然后利用體內(nèi)或體外重組酶進行連接,，得到重組片段,；但兩者用到的酶卻完全不同。我們一起來了解無縫克隆的秘密,。
Gibson Assembly原理
Gibson Assembly是由Daniel Gibson和J.Craig Venter在2009年提出的,。Gibson Assembly要求目的片段與線性化載體首尾具有一段互補重疊的同源臂序列；利用T5 exonuclease的5’一3’外切酶活性產(chǎn)生3’黏性末端,，之后同源臂進行互補配對,，再利用DNA polymerase延伸補齊片段上的缺口部分，最后通過Taq DNA Ligase連接DNA片段中的缺刻,，完成克隆組裝,。
Gibson Assembly原理示意圖
In-Fusion Cloning原理
In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能夠識別3’末端堿基，具有3’→5’外切酶活性的特點,。通過In-Fusion酶產(chǎn)生5’黏性末端,，互補重疊片段退火配對；再將重組片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞內(nèi),，重組片段序列中的缺刻在菌體內(nèi)進行連接,，獲得重組序列。
In-Fusion Cloning原理示意圖
無縫克隆的優(yōu)勢
傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)依賴于Ⅱ型限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶的使用,，DNA片段與載體經(jīng)相同的限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生相同的末端，然后利用T4 DNA連接酶反應(yīng)實現(xiàn)片段融合,。這種方法受到酶切位點限制,，需選擇片段與載體序列內(nèi)部沒有,、而僅在載體多克隆位點存在的酶切位點。酶切連接的方法一次只能連接單個片段,，無法實現(xiàn)多片段同時連接,。且該方法中T4 DNA連接酶的輔助因子ATP易失活，影響克隆效率,。無縫克隆與傳統(tǒng)的酶切連接相比,，具有以下優(yōu)勢：
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不受酶切位點限制
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適用于任意載體、任意片段
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一步連接1或多個片段,，連接多片段耗時短
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插入目的片段兩端不會添加額外序列（如保護堿基）
無縫克隆實驗關(guān)鍵影響因素
自無縫克隆技術(shù)被大家認識后,，得到了眾多老師的青睞，但同時也有部分質(zhì)疑：連接效率為何總是不盡如人意,？我們來細數(shù)影響無縫克隆實驗的關(guān)鍵因素有哪些,？
無縫克隆實驗流程
片段質(zhì)量
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確保DNA片段無核酸酶及其它酶污染、無乙醇等殘留,；
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純度正常：A260/A280值在1.6-1.9,、A260/230值在2左右、紫外吸收峰圖正常,；
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濃度正常：插入片段與線性化載體濃度高于50 ng/μl,，會使重組效率提高；
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若模板濃度低,、純度低,，則連接效率降低。
載體線性化方法
線性化載體可以選擇反向PCR或酶切的方法：
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可根據(jù)在載體插入位置是否有合適的酶切位點選擇具體方法,。因Gibson Assembly反應(yīng)體系內(nèi)無雙鏈DNA連接酶,，不會發(fā)生載體自連，線性化載體不需要進行末端去磷酸化處理,。酶切制備線性化載體建議使用雙酶切,，且酶切后采用膠回收的方法回收產(chǎn)物，這樣利于降低假陽性,。
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若沒有合適酶切位點或者多次酶切制備線性化載體均不成功,，可以選擇反向PCR擴增，但不適合較大質(zhì)粒,，如超過8 kb,。
引物設(shè)計
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目的片段引物設(shè)計：目的片段引物是由目的片段兩端序列加同源臂序列組成，同源臂長度設(shè)置在16-45 bp,，Tm值在58–65°C,。同源臂越長，有利于重組置換,，但可能會影響目的片段擴增,；
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載體引物設(shè)計：確定目的片段插入位置,，推薦借助Snapgene軟件設(shè)計反向PCR引物。
PCR擴增
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反向PCR制備線性化載體及擴增目的片段時需要使用高保真酶,；
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制備線性化載體后使用Dpn I內(nèi)切酶消化環(huán)狀質(zhì)粒模板,，降低假陽性克隆。
插入片段與線性化載體摩爾比
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10 µl 反應(yīng)體系,，載體與插入片段總加入量建議在 0.01-0.3 pmol,。插入片段與線性化載體的最佳摩爾比為 1:1-4:1；片段與片段的摩爾比為1:1,。
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感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率
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插入片段與載體全長超過10 kb,，屬于長片段克隆,，應(yīng)使用高效感受態(tài)；如：轉(zhuǎn)化效率大于108 cfu/μg DNA的感受態(tài)細胞,。
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感受態(tài)細胞與重組質(zhì)粒用量比例不小于10:1,。
只要注意以上幾點，高效無縫克隆實驗輕松get,。
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