隨著常規(guī)PCR技術(shù)在分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象也經(jīng)常出現(xiàn),，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性,。
非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生和影響
普通的Taq DNA 聚合酶的最適溫度是72℃,，此時(shí)酶的活性最佳，低于此溫度,，酶有較弱活性,。在PCR擴(kuò)增的升溫過程中，酶發(fā)揮較弱的活性,，體系極易錯配或形成引物二聚體,，尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)的引物3’端是G 或C，錯配的鏈很難重新解開,。非特異性擴(kuò)增正是由于DNA聚合酶低溫下具有活性而引起的錯誤引導(dǎo)靶標(biāo)延伸和引物二聚體形成的,。
非特異性擴(kuò)增的具體影響包括：
目標(biāo)擴(kuò)增子產(chǎn)量低,；
目標(biāo)擴(kuò)增子的靈敏度下降；
下游應(yīng)用效果不佳,。
因此,，要提高PCR 擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯配率，可以人為的控制酶的活性,，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫（或配置反應(yīng)體系）過程中發(fā)生鏈的錯配,，從而保證擴(kuò)增的特異性,。
而目前最常用的提高PCR特異性的方法是使用熱啟動型Taq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，即熱啟動PCR,。
熱啟動PCR
熱啟動PCR,，主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活,，酶活得以釋放,，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。
熱啟動PCR的優(yōu)勢：
阻止引物與低同源性的模板序列結(jié)合,；
在PCR反應(yīng)開始之前,，防止引物與引物之間形成引物二聚體；
提高目的片段的擴(kuò)增靈敏度和產(chǎn)量,；
可在室溫下配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)程序,，使操作更為便利，且不會影響擴(kuò)增性能和特異性,。
熱啟動 Taq DNA聚合酶的修飾方法
熱啟動Taq DNA 聚合酶常用的修飾方法有化學(xué)修飾法,、抗體法和配體修飾法等。其中化學(xué)修飾法和抗體法最為常用,。雖然它們都能抑制室溫下的聚合酶活性,，但兩者之間存在一些差異。
化學(xué)修飾法
化學(xué)修飾法熱啟動Taq DNA聚合酶：一般采用化學(xué)小分子,，如酸酐,，與聚合酶上的氨基酸基團(tuán)（賴氨酸）結(jié)合，使酶低溫時(shí)失去酶活,。加熱至特定溫度和時(shí)間后,，化學(xué)小分子與氨基酸之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放,，從而達(dá)到熱啟動效果,。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性,，操作簡單,，酶活性釋放速度較慢,，酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價(jià)比更高,。
但是,，酶激活時(shí)間較長可能會影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低,。
檸康酸酐與酶結(jié)合的原理
一般認(rèn)為Taq DNA聚合酶上賴氨酸基團(tuán)有42個(gè)左右,，但是由于空間結(jié)構(gòu)限制，其中一部分賴氨酸基團(tuán)在基團(tuán)內(nèi)部,，無法與化學(xué)修飾基團(tuán)相結(jié)合,。
抗體法
抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶：一般使用Taq DNA聚合酶抗體，在PCR反應(yīng)高溫加熱前,，抗體與DNA聚合酶結(jié)合,，封閉酶活性。在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性,，解除封閉從而釋放酶活性,。此外，抗體型熱啟動酶由于酶活釋放速度快,，可大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間,，且具有更高的靈敏度和擴(kuò)增效率。
但其缺點(diǎn)是抗原抗體結(jié)合是一種動態(tài)平衡,，試劑配比優(yōu)化時(shí)間長,。
抗體與DNA聚合酶特異性結(jié)合封閉原理示意圖
兩種熱啟動修飾方法的比較
優(yōu)質(zhì)的熱啟動 Taq DNA聚合酶
熱啟動PCR目前的應(yīng)用已是非常廣泛，在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如基因組DNA,、單拷貝序列的擴(kuò)增,、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增中的應(yīng)用尤為突出。
優(yōu)質(zhì)的熱啟動Taq DNA聚合酶,，能有效降低或消除非特異性產(chǎn)物以及引物二聚體的形成,，提高引物與模板結(jié)合的效率。進(jìn)一步提高目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物量,，使PCR反應(yīng)更趨于完美,。
GenStar相關(guān)產(chǎn)品：
HotStart Taq DNA Polymerase（Cat#A131）
靈敏快速：抗體修飾熱啟動酶，擴(kuò)增靈敏度更高,，反應(yīng)速度快,；
性能優(yōu)異：擴(kuò)增效率高，重復(fù)性好,，跨度均一,；
兼容性強(qiáng)：適用于各種PCR或qPCR反應(yīng)體系。
HotStart Power Taq DNA Polymerase（Cat#A135）
特異性強(qiáng)：化學(xué)修飾熱啟動酶,，酶活封閉更完全,，有效抑制非特異性擴(kuò)增,；
性能穩(wěn)定：95℃加熱10 min，徹底釋放酶活性,；
適合復(fù)雜模板：適用于從復(fù)雜模板中擴(kuò)增低拷貝基因,。
產(chǎn)品列表
主要參考資料:
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