癌癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,，目前學(xué)界廣泛接受的觀點(diǎn)是相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因。即在各種因素的影響下：
原癌基因產(chǎn)生突變,，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng),；
抑癌基因失活,，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與休眠紊亂，不能正常凋亡,。
最終質(zhì)變?yōu)榧?xì)胞及組織水平的變異,，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。
所以癌癥的發(fā)生和發(fā)展實(shí)際上是一個(gè)較為漫長(zhǎng)的過(guò)程,，在臨床中,，完全可以通過(guò)基因檢測(cè)，達(dá)到早發(fā)現(xiàn),、早診斷,、早治療的目的。
目前,，癌癥相關(guān)基因檢測(cè)主要基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和高通量測(cè)序（NGS）兩項(xiàng)技術(shù),，其中qPCR具有多項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng),、靈敏度高,、操作簡(jiǎn)單、成本較低,，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及臨床診斷中,。
今天，我們就來(lái)好好聊一聊qPCR
探針?lè)╭PCR 技術(shù)原理：
qPCR依據(jù)檢測(cè)原理不同,，分為染料法和探針?lè)?。探針?lè)╭PCR需針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)特異性引物與特異性熒光探針,，探針的5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter，如FAM,、VIC,、HEX等），3’端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（Quencher,，如TAMRA,、BHQ1等）。
當(dāng)熒光探針保持結(jié)構(gòu)完整時(shí),，探針與模板退火結(jié)合,，其特異性結(jié)合位點(diǎn)位于正反兩條引物之間。5’端報(bào)告基團(tuán)受儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3’端淬滅基團(tuán)淬滅,，儀器檢測(cè)不到5′端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào),。
隨著擴(kuò)增進(jìn)行，DNA聚合酶在延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針,，因其雙鏈特異性的5’-3’外切酶活性,，就會(huì)切割熒光探針，釋放5’端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中,，遠(yuǎn)離3’端淬滅基團(tuán),，此時(shí)5’端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)就可以被儀器檢測(cè)到。每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)游離的熒光分子形成,，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，最終通過(guò)數(shù)據(jù)分析實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量,。
圖1. 探針?lè)╭PCR技術(shù)原理示意圖
作為一種有效的癌癥篩查檢測(cè)及伴隨診斷技術(shù),，探針?lè)╭PCR涉及領(lǐng)域涵蓋癌癥的預(yù)防與治療。這項(xiàng)技術(shù)不但能有效地檢測(cè)到基因的突變,，還可以準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量,。
qPCR應(yīng)用于癌癥篩查
探針?lè)╭PCR目前已廣泛應(yīng)用于多種癌癥相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)，包括：
端粒酶hTERT基因
慢性粒細(xì)胞性白血病WT1基因
腫瘤ER基因
前列腺癌PSM基因
宮頸癌相關(guān)病毒HPV
……
其中女性高發(fā)惡性腫瘤之一的宮頸癌,，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療,，可以達(dá)到非常好的療效，治愈率在90%左右,。目前已證實(shí)高危人乳頭瘤（HPV）病毒持續(xù)感染與宮頸癌有著密切聯(lián)系,，因此，對(duì)于高危HPV病毒的專(zhuān)項(xiàng)檢測(cè),，已成為宮頸癌篩查的重要手段,。高危HPV病毒核酸檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查被越來(lái)越多的應(yīng)用于臨床。
圖2. 高危HPV病毒核酸檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合篩查可有效降低漏診率
qPCR應(yīng)用于抗癌藥物研發(fā)
除此之外,，探針?lè)╭PCR還可應(yīng)用于抗癌藥物的研發(fā),。在新藥的開(kāi)發(fā)過(guò)程中,，快速了解藥物對(duì)癌癥進(jìn)程的影響可以為新藥開(kāi)發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金,。
與Elisa等方法相比,，探針?lè)╭PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確,、靈敏地測(cè)定血液或組織中目的基因的表達(dá)量,，為比較不同配方的療效、用藥量,、用藥時(shí)間等,，提供快速、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià),。
圖3. qPCR檢測(cè)流程示意圖
手把手實(shí)驗(yàn)教學(xué)
p53是重要的抑癌基因，幾乎參與所有癌癥的發(fā)生與發(fā)展,，其編碼蛋白有促使損傷DNA修復(fù),、損傷細(xì)胞凋亡從而防止癌變的功能。
假設(shè)現(xiàn)在有兩種配方藥物,，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,，看不同配方藥物對(duì)p53 mRNA水平的影響，應(yīng)該怎樣來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以及分析結(jié)果呢,？
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
分別種三皿細(xì)胞,，一皿加入配方一藥物，另外一皿加入配方二藥物,，剩下一皿加入對(duì)照,。處理一段時(shí)間之后，分別收集細(xì)胞并提取RNA,，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行qPCR。qPCR如下圖所示進(jìn)行加樣：
圖4. qPCR加樣示意圖
注意區(qū)分 “技術(shù)重復(fù)”和“生物學(xué)重復(fù)”這兩個(gè)概念,，圖4中p53和β-actin每個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都各有三個(gè)qPCR復(fù)孔,，這是技術(shù)重復(fù)，目的是消除本次實(shí)驗(yàn)的操作誤差,。生物學(xué)重復(fù)指的是做三次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn),，目的是消除組內(nèi)誤差、提高結(jié)果的可靠性,。在本例中,，就要求在其他時(shí)間另外再種三皿細(xì)胞，再分別處理后提取RNA,，接著再做反轉(zhuǎn)錄和qPCR,，如此做了三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)之后才能算作三次生物學(xué)重復(fù),，統(tǒng)計(jì)誤差的來(lái)源應(yīng)該包括生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。
做完上述實(shí)驗(yàn)之后,，假設(shè)得到結(jié)果如下：
表1. Test1 Ct值結(jié)果
再做兩次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),，假設(shè)得到結(jié)果如下：
表2. Test2 Ct值結(jié)果
表3. Test3 Ct值結(jié)果
結(jié)果分析:
下表為完整計(jì)算過(guò)程（ΔCt=Ct p53-Ct β-actin；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組）：
表4. 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法示例
整理一下數(shù)據(jù)（相對(duì)表達(dá)量平均值=2-ΔΔCt平均值）：
表5. p53相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)
就可以生成p53 mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量柱形圖了：
圖5. p53 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量柱形圖
到這里,，離獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)論只有一步之遙,。還需要確定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間是否存在顯著性差異。
首先需要確定的是,，用什么方法來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn),？
因?yàn)楦鲗?shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間毫無(wú)相關(guān)存在，所以應(yīng)該采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法,?？梢允褂肧PSS統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)統(tǒng)計(jì)P值，也可以直接使用Excel軟件來(lái)進(jìn)行t檢驗(yàn),。
P<0.05代表存在顯著性差異
P<0.01代表存在極顯著差異
在本例中,，配方一實(shí)驗(yàn)組P值<0.01，配方二實(shí)驗(yàn)組P值
配方一藥物處理極顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá),。
配方二藥物處理顯著提高了p35 mRNA水平的表達(dá),。
總結(jié):
需要強(qiáng)調(diào)的是，本文例舉的方法只適用于單因素處理的比較,，該因素（本例中為加藥）處理得到的結(jié)果應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的,。在本例中，即表示在相同細(xì)胞中加相同濃度的相同配方藥物,，p53 mRNA的變化水平應(yīng)當(dāng)是一致的,。
探針?lè)╭PCR能夠快捷地提供更加客觀、精確的基因定量檢測(cè)結(jié)果,，對(duì)高發(fā)癌癥的普查和診斷,、相關(guān)藥物的研發(fā)具有重要意義。
但這項(xiàng)技術(shù)也存在假陽(yáng)性導(dǎo)致過(guò)度診斷的問(wèn)題,，可采用探針?lè)╭PCR同時(shí)檢測(cè)多個(gè)相關(guān)基因,，或與其他一些技術(shù)如細(xì)胞學(xué)檢測(cè)等結(jié)合應(yīng)用，進(jìn)行綜合性指標(biāo)分析,。
康潤(rùn)生物(GenStar?) 探針?lè)╭PCR試劑
重點(diǎn)產(chǎn)品推薦
2×RealStar Fast探針?lè)╭PCR預(yù)混液（Cat#A351）
易檢：靈敏度更高,，適合低拷貝基因，易檢出,。
更快：預(yù)混型一管化設(shè)計(jì),，使用方便；可進(jìn)行多重檢測(cè),，一次檢出多個(gè)基因,。
更穩(wěn)：重復(fù)性好,，產(chǎn)品性能穩(wěn)定。
更準(zhǔn)：采用抗體型修飾熱啟動(dòng)酶,，特異性好,，結(jié)果更準(zhǔn)確。
更低：性?xún)r(jià)比高,，實(shí)驗(yàn)成本更低,。
相關(guān)產(chǎn)品信息
