這個問題出自XXX領(lǐng)導(dǎo)之口
那小編我著實(shí)需要好好捋捋
為此小編我整日抓耳撓腮
百思不得其解
按理來說，RNA的質(zhì)量沒問題（28s和18s rRNA是否清晰,、明顯，亮度比符合2:1）,，那么RT產(chǎn)生的cDNA一般是不會出現(xiàn)問題的。但是偏偏有那么些個博學(xué)多才,、才高八斗的抖機(jī)靈們想要一探究竟,！
作為2G沖浪選手，小編我也機(jī)靈了一回
聽聽學(xué)霸網(wǎng)友們的聲音
一號學(xué)霸：
一般可以用電泳檢測是否合成適當(dāng)大小片段的帶,，這方法看cDNA大小沒問題（自信）,；如果想看堿基那當(dāng)然還是測序或者使用探針檢測，就是比較麻煩（一如既往的自信）,。
cDNA的質(zhì)量不好判斷,，因?yàn)閏DNA產(chǎn)物是smear，所以只能根據(jù)smear的分布范圍大概估計cDNA的質(zhì)量,，分布范圍越大越好,。但是，電泳看到的smear因?yàn)檫€和加樣量相關(guān),，所以即使沒有看到分布很廣的cDNA一鏈,，也并不等于它不存在（淡定如斯）。
三號學(xué)霸：
用PCR檢測合成的cDNA中管家基因的量,，如果出現(xiàn)比較好條帶,，基本可以證實(shí)你的cDNA沒有問題，我們實(shí)驗(yàn)室一直這樣控制（眾人）。
如果不怕煩的話,，可以在反轉(zhuǎn)第一鏈時加入少量同位素標(biāo)記的dNTP,，然后看一下放射比活度或做個放射自顯影（別出心裁）。
五號學(xué)霸：
首先看你用什么方法合成cDNA,，如果隨機(jī)引物合成,，三號的建議可以考慮（因?yàn)楣芗一蚱味鄶?shù)較短）,。如果是LD PCR,，則這些內(nèi)參可能無法檢驗(yàn)結(jié)果的好壞（有條有理）。
ds?cDNA檢測我倒是做過（LD PCR）,，理論上由總RNA起始的,，哺乳動物應(yīng)該1.2%濃度的瓊脂糖凝膠于0.5~6kb（可達(dá)10kb以上）有明顯的smear，且有一些明顯的亮帶（腦,、脾,、胸腺除外）（過來人代表）。
七號學(xué)霸
做內(nèi)參照??！如GAPDH,β-actin,β-MG等（言簡意賅）。
.........（好多學(xué)霸,，真好?。?/span>
這么多學(xué)霸出謀劃策，你,，懂了嗎,？
為了防止有人和小編一樣可愛，英語,、術(shù)語分不開,，我先來解釋一下：
Smear：彌散帶
LD PCR：全稱Long Ditance PCR即長片段PCR
ds?cDNA：指依靠DNA聚合酶，與cDNA相互補(bǔ)的第二鏈cDNA
選擇試劑盒：您做RT實(shí)驗(yàn)想得到什么樣的產(chǎn)物呢,？
產(chǎn)品推薦
不含RNase H（合成長度更長）
預(yù)混組分（簡單高效快捷）
一步法（輕松得到雙鏈cDNA）
?如何檢測第一鏈cDNA合成成功？?
cDNA電泳檢測（大多數(shù)學(xué)霸推薦,，簡單快速,，但需注意特殊情況）
? ? ? ?取約5ul反應(yīng)產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳,，EB染色,，紫外成像檢測，呈現(xiàn)出大小在200-10Kb的拖帶,，其中重心區(qū)域小1-4Kb之間,，這說明反轉(zhuǎn)錄完全，得到了高質(zhì)量的cDNA（如果RNA豐度低，電泳也可能是無產(chǎn)物,，但是這種情況不代表PCR會無結(jié)果）,。
cDNA測序（受限較多，但結(jié)果精準(zhǔn)）
? ? ? ?全長雙鏈cDNA做分子克隆實(shí)驗(yàn),，然后通過測序結(jié)果精確判斷,。
a.? Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解決poly(A) mRNA模板限制和長度限制的問題
b.? 序列特異性引物可獲得你想要得目的序列
探針檢測（相對較麻煩，但結(jié)果較精準(zhǔn)）
? ? ? ?qPCR或RT-qPCR步驟
管家基因/內(nèi)參基因（引物類型限制,，適用范圍受限）
? ? ? ?以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,，擴(kuò)增內(nèi)參基因，擴(kuò)增有結(jié)果,，說明cDNA的質(zhì)量基本可以保證,，這個方法限制于隨機(jī)引物擴(kuò)增（因?yàn)楣芗一蚱味鄶?shù)較短）。
? ? ? ?而Oligo(dT)18與序列特異性引物擴(kuò)增或我們做LD PCR（2kb,、10kb等長片段）時,，這些內(nèi)參擴(kuò)增的幾率遠(yuǎn)大于全長或大片段cDNA的擴(kuò)增，這時可能就無法通過內(nèi)參來檢驗(yàn)cDNA擴(kuò)增結(jié)果的好壞,。
同位素標(biāo)記
? ? ? ?反轉(zhuǎn)錄中加入少部分同位素標(biāo)記的dNTP
? ? ? ?放射比活度或放射自顯影檢測
